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    仔豬腹瀉綜合征(NPDS)初步研究
    http://www.dzyan360.cn | 時間:2012-11-20 08:41:35 | 關注人次[] | 字體設置:

    韓健寶  南京農業大學動物醫學院

    鄧小紅  揚州大學獸醫學院

    一、 病料處理

    分別取解凍的待檢病料10g 左右(在冰上進行操作),用滅菌的手術剪剪碎,加入適量的生理鹽水或PBS 溶液(pH7.2)混勻,用滅菌的研磨器充分研磨,再用2ml Eppedorf 管分裝,反復凍融2-3 次,4℃冷凍離心機離心8000r/m,10min,取上清液,置-70℃保存備用。

    二、 病毒液、病料中病原DNA 模板的制備

    2.1 圓環病毒及偽狂犬病毒的DNA 提取

    取447.5ul 上清液,加50uL10%的SDS,震蕩混勻;加入2.5uL 蛋白酶(PEK),混勻;放入58℃水浴鍋中,充分裂解2h,再加入水飽和酚250ul,三氯甲烷240ul,異丙醇10ul,混勻,12000 轉/分離心5min;取上清400ul加1/10 體積的醋酸鈉40ul,2 倍體積的無水乙醇800ul,混勻,置于-20℃進行DNA 沉淀1h;12000r/m 離心20min,棄去上清,加入1000ul 70%乙醇洗滌沉淀,再棄去上清進行干燥,干燥后加入滅菌雙蒸水50ul 將DNA 溶解,-20℃保存備用。

    2.2 豬瘟病毒、藍耳病病毒及輪狀病毒的RNA 提取及反轉錄

    采用天澤基因生產的柱式動物RNAout 試劑盒提取樣品RNA。按照說明書提取,樣品管中A 液和B 液各加450ul,再加入300ul 樣品上清液,混勻;加氯仿250ul,混勻,12000r/m 離心5min,取700uL 無色透明水相于通用離心柱中,12000r/m 離心1min,加入通用洗柱液700ul,再重復離心步驟;棄去離心吸附柱,換成離心管,每管加50ul 洗脫液,再次離心1min,-20℃保存備用。

    將RNA 反轉錄成cDNA,反應體系:DEPC 6uL+RNA 5ul+引物1ul+dNTP 2ul,65℃反應2min,在降溫至4℃保持5min。再向反應管中加入5*buffer 4ul+Ribolock Rnase Inhibitor 1ul+M-MLV 1ul,30℃反應10min。

    三、 引物設計與合成

    根據基因文庫提供的和已發表的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 和PEDV序列,應用計算機軟件DNAstar 在保守區域基因序列保守區的五對引物。該引物設計完成后, 通過計算機網站(http://www.ncbi. Nlm.nih.gov/BLAST/)對其進行分析,結果具有良好的特異性。引物序列如下:CSFV 上游引物:5’-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3’下游引物:5’-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3’PRRSV 上游引物: 5’-GCGGATCCATGCCAAATAACAAC-3’下游引物: 5’-AGCTCGTTTCATGCTGAGGGTGA-3’PRV 上游引物: 5’-AGGACGAGTTCAGCGACG-3’下游引物: 5’-AACAGGCGGTTGGCGGTCAC-3’PCV2 上游引物: 5’-GACCTGTCTACTGCTGTGAGTA-3’下游引物: 5’-AAATTCAGGGCATGGGGGGGAA-3’PEDV 上游引物:5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3’下游引物:5’-GATCCTGTTGGCCATCC-3’

    四、 PCR 擴增及鑒定

    采用天澤基因PCR 試劑盒,30ul 反應體系:DNA(cDNA) 2-4uL+PCR Mix15ul+引物1-2ul+滅菌雙蒸水 9-11ul,采用95℃預變性5min,94℃50s,52-59℃不同溫度進行退火50s,72℃延伸1min,共35 個循環;最后72℃延伸10 min,產物4℃保存。

    五、 結果與分析

    病原分析結果如下(表1.)

    仔豬腹瀉綜合征(NPDS)初步研究

    六、預防控制思路

    據調查研究顯示,我國及東南亞地區目前新生仔豬腹瀉高發病率高死亡率與母豬群遭受野毒持續侵染,形成感染壓力呈正相關,凡是在重胎期出現一過性腹瀉、體況不良、食欲不佳、產程過長、奶水不足、乳房炎與子宮炎及返情、產死胎率高的母豬群所產的新生仔豬發生腹瀉病率顯著的增高。另外,國內豬場母豬貢獻成品肉豬的生產水平普遍不到發達養豬國家的60%,大量的種豬存在不同程度的繁殖障礙,由于母豬的生產性能低下,又加上疾病的頻頻發生,豬場的盈利危機四伏。在豬場中有著相當多的公豬表現死精、弱精、甚至無精;母豬表現出的屢配不孕、死胎、流產、產弱仔、便秘、奶水不足、采食量不正常等亞臨床現象。存在的這些現象中,有超過80%是由于野毒在種豬群中循環并持續侵染種豬的生殖系統上皮細胞,導致卵巢、輸卵管、子宮、精囊腺、睪丸等組織器官細胞大量凋亡。

    俗話說的好,母豬好好一窩、公豬好好一坡,在重胎期與哺乳期母豬飼喂過程中,采用益百特(肽核酸---一種新型的抗病毒免疫調節功能性添加劑)添加到哺乳母豬料中(產前三周至斷奶),對母豬群實施病毒感染良好控制與凈化方案是解決如“新生仔豬腹瀉綜合征(NPDS)”、“母豬繁殖障礙綜合征”這些問題的關鍵!

    七、發病豬群臨床控治措施

    產房新生仔豬腹瀉主導病因為受母體病毒感染壓力影響,故在處理產房新生仔豬腹瀉時不能僅僅針對仔豬用藥,必須采用益百特來同時出處理產房母豬和新生仔豬,只有從源頭上(飼喂哺乳料料階段母豬)控制(減少母豬通過胎盤屏障垂直感染胎兒和通過乳汁排毒飼喂乳豬),才能有效控制新生仔豬腹瀉,具體措施如下:

    A:母豬

    A-1:產前三周(通常從換哺乳母豬料)開始添加益百特至斷奶,益百特TM (拌

    料型或水溶型) 500-800g/噸;

    A-2:分娩當天肌注益百特TM 注射液6-8ml/頭份,間隔3 天再肌注一次。

    B:乳、仔豬

    B-1:發病乳、仔豬豬治療,肌注益百特TM 注射液(按體重20kg/ml)+頭孢噻呋鈉+阿托品(功能:緩解消化道平滑肌蠕動、止瀉),兩天一次,連續肌注2-3 次;或益百特TM 注射液 0.2ml+ 霉克樂™ 5-10g/頭份灌服(即:以10 頭豬/窩計,分別取益百特TM 注射液 2ml 和霉克樂™ 50-100g 加入200ml 熱開水中攪拌形成混懸液,用一次注射器吸取20ml 灌入乳豬口中咽下,1-2 次/日。)

    B-2:如果某豬場發病規律通常是5 日齡內出現腹瀉,那么應予以緊急預防性給藥,從仔豬出生當天、3 日齡(即1 日齡、3 日齡),兩次各肌注益百特TM 注射液 0.1ml/頭份(<3kg 體重);

    B-3: 斷奶后保育仔豬發生腹瀉,能夠采食的發病豬群采用益百特TM (拌料型) 1000g+ 君特泰克TM (拌料型) 3000g+霉克樂™3000g/噸全價料,連續飼喂7-10 天或益百特TM (水溶型)500g+ 君特泰克TM (水溶型) 300g+電解多維連續飲水7 天,霉克樂™3000g/噸全價料,連續飼喂7-10 天。

    提示:一定要搞好產房環境衛生,保持干燥、溫暖。

     來源:豬病新干線  作者:韓健寶 鄧小紅 
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