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    豬偽狂犬病研究進展
    http://www.dzyan360.cn | 時間:2011-07-03 07:23:50 | 關注人次[] | 字體設置:

    摘 要:偽狂犬病又稱奧葉基氏病,是由偽狂犬病病毒引起的多種家畜和野生動物的一種高度接觸性、急性傳染病。豬是該病的主要宿主和傳染源,感染仔豬出現發熱、腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、麻痹、共濟失調;母豬出現繁殖障礙,給世界養豬業造成了巨大的損失。豬偽狂犬病是嚴重危害養豬業的重要疫病之一,國內外眾多學者對其進行了大量研究,建立了多種診斷與鑒別診斷方法,研制了不同類型的疫苗。文章對該病的病原學、流行病學、臨床癥狀、病理變化、診斷和防控方面的研究進展做一綜述,重點介紹豬偽狂犬病的診斷與抗原、抗體檢測方法。

    關鍵詞:豬偽狂犬;診斷;檢測方法

    豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬是本病的主要宿主和傳染源,健康豬與病豬、帶毒豬直接接觸可感染本病。通常引起妊娠母豬流產、木乃伊胎、死胎和產弱仔;初生仔豬出現神經癥狀,感染率和死亡率可達100%,成年豬感染后多耐過,不發病呈隱性感染,造成長期帶毒排毒,成為最危險的傳染源,嚴重影響種豬場生產。本病廣泛分布于世界各地,已有50多個國家和地區報道該病的流行,給養豬業構成很大威脅。我國自1947年首次報道該病以來,隨著養豬業集約化規;陌l展,已有20多個省市報道發生了該病,并在許多種豬場呈暴發流行趨勢,給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

    1 病原學

    PRV屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科,豬皰疹病毒Ⅰ型。其完整病毒粒子為圓形,直徑150 nm~180 nm,核衣殼直徑為105 nm~110 nm。有囊膜,囊膜表面有長約8 nm~10 nm呈放射狀排列的纖突。

    PRV對外界環境的抵抗力較強,55 ℃ 50 min、80 ℃ 3 min或100 ℃瞬間才能將病毒殺滅。在低溫潮濕環境下,pH 6~8時病毒能穩定存活;在干燥條件下,特別是在陽光直射下,病毒很快失活。PRV對乙醚、氯仿、福爾馬林等各種化學消毒劑都敏感。

    PRV只有一種血清型,但不同毒株在毒力和生物學特性等方面存在差異。PRV具有泛嗜性,能在多種組織培養細胞內增殖,并產生明顯的細胞病變和核內嗜酸性包涵體,其中以兔腎和豬腎細胞最為敏感。

    PRV基因組為線狀雙鏈DNA,大小約180 kb,G+C含量高達74%。病毒基因組由長獨特區(Unique long region,UL)、短獨特區(Unique short region,US)以及位于US兩側的末端重復序列(Terminal repeat,TR)與內部重復序列(Internal repeat,IR)組成。對PRV基因組序列測定發現其由72個閱讀框組成,可編碼70種蛋白,目前已發現和命名的有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN 11種糖蛋白。編碼gC、gE、gG、gI、gM和gN的基因為病毒復制非必需的,gB、gC、gD、gE和gI與病毒的毒力有關[1]。此外,胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)、核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase,RR)、蛋白激酶(Protein kinase,PK)、堿性核酸外切酶(Alkaline exonuclease,AN)和脫氧尿苷三磷酸激酶(Deoxyuridine triphosphokinase,dUTPase)等幾種酶也與病毒的毒力密切相關,其中TK是PRV最主要的毒力基因。糖蛋白gB、gC、gD在免疫誘導方面最為重要[2]。

    2 流行病學

    PRV可引起多種家畜和野生動物感染,各種年齡的豬、牛均易感,而且豬是PRV的儲存宿主和傳染源,尤其耐過的呈隱性感染的成年豬是該病的主要傳染源。在自然條件下PRV還能感染羊、犬、貓、兔、鼠、水貂、狐等動物。實驗動物中家兔、豚鼠、小鼠都易感,但以家兔最敏感。

    PRV可通過消化道和呼吸道傳播,也可通過交配、精液、胎盤垂直傳播。PRV通過胎盤傳遞給胎兒時,由于母豬免疫球蛋白不能通過胎盤屏障,所以病毒對胎兒的感染性是致命的?諝鈧鞑ナ荘RV擴散的最主要途徑,被污染的飼料、帶毒的鼠、羊等動物也可傳播本病。

    3 臨床癥狀

    病豬的臨床癥狀和病程隨年齡和毒株毒力不同有所差異,哺乳仔豬最為敏感,15日齡以內的仔豬常表現為最急性型,病程不超過72 h,病死率100%,主要表現為高熱、拉稀、嘔吐、共濟失調、角弓反張、四肢泳動等神經癥狀,最后昏迷死亡,第3天至第7天為死亡高峰期。斷奶豬也能引起死亡,但主要表現為神經癥狀、拉稀、嘔吐等。育肥豬則大多數伴有高熱、厭食和呼吸困難,偶有神經癥狀,一般不發生死亡。成年豬常不呈現可見臨床癥狀或僅表現為輕微體溫升高,一般不發生死亡,耐過后呈長期潛伏感染、帶毒或排毒。懷孕母豬常發生流產、產木乃伊胎或死胎,且以產死胎為主。豬偽狂犬病的另一發病特點是種豬不孕癥,感染母豬屢配不孕,返情率增高;感染公豬睪丸腫脹、萎縮、喪失種用能力。

    4 病理變化

    PRV感染一般無特征性病變,主要肉眼病變為上呼吸道黏膜及扁桃體出血水腫,胃腸黏膜可見卡他性或出血性炎癥,中樞神經系統癥狀明顯時,腦膜充血、出血、水腫,腦脊髓液增多。組織學病變主要是中樞神經系統的彌散性非化膿性腦膜腦炎及神經節炎,有明顯的血管套及膠質細胞壞死。在腦神經細胞內、鼻咽黏膜、脾及淋巴結的淋巴細胞內可見核內酸性包涵體[1]。

    5 診斷

    本病僅根據臨床癥狀及流行病學特點很難作出診斷,確診需要借助實驗室診斷技術。為了建立適合本病診斷和流行病學調查的方法,國內外許多學者進行了大量的研究。目前,豬偽狂犬病檢疫、診斷常用的方法有病毒分離、免疫熒光抗體試驗、血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、核酸探針技術、聚合酶鏈式反應技術等。

    5.1 病毒分離與鑒定

    病豬的腦組織(中腦和腦橋含毒量最多)和扁桃體作為分離病毒檢樣尤為理想,其次是肝、腎、脾等組織臟器。對亞臨床感染的豬多采取鼻咽洗液作為分離病毒的樣品。通常用100 g/L的腦組織懸液離心后取上清液作為感染動物或細胞培養物的接種材料。豬腎傳代細胞、倉鼠腎傳代細胞、雞胚成纖維細胞等均可用于病毒分離。在接種后24 h~72 h可出現典型的細胞病變,將細胞培養物進行HE(Hematoxylin­eosin,HE)染色,鏡檢可發現酸性核內包涵體。

    將處理的病料經腹側皮下接種家兔,通常在接種后36 h~48 h注射部位出現劇癢,動物自行啃咬,直至掉毛、破損和出血,繼之四肢出現麻痹。病程很短,試驗兔多于出現癥狀后數小時死亡。分離到病毒后應用標準陽性血清作中和試驗,可采用常規的病毒稀釋法或血清稀釋法,如能采用蝕斑減數試驗法更佳,不僅結果精確,還能根據蝕斑直徑的大小,了解新分離毒株的毒力強弱情況。

    5.2 血清學試驗

    多種血清學方法可用于豬偽狂犬病的診斷,應用最廣泛的有血清中和試驗(serum neutralization test,SNT)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme­linked immunosorbent assay,ELISA)、乳膠凝集試驗(latex agglutination test,LAT)、間接免疫熒光技術(indirect fluorescent antibody technique,IFA)等。其中血清中和試驗的特異性、敏感性最好,但由于技術條件要求高、時間長,難以在臨床應用。而ELISA方法同樣特異性強、敏感性高,可用于大批量樣品的檢測;乳膠凝集試驗也以其操作簡便、快速的優點在臨診上廣泛應用。

    5.2.1 免疫熒光抗體試驗 Stewart等首先應用熒光抗體染色法檢查以病毒和病料接種的PK­15培養物,獲得了良好結果。其對豬不同部位的檢樣做比較,發現扁桃體和淋巴結的檢出率最高,大腦次之,再次為脾和脊髓。Sabo等建立了檢測實驗感染和自然感染PR的豬臟器冰凍切片的直接FA技術,其檢出腦組織中病毒抗原的最小量為104.5TCID50/g。Allan G M等[3]建立了檢測PRV實驗感染豬和自然感染豬腦及咽壓印片的間接免疫熒光技術,病毒抗原最低檢出量為101.3 TCID50/g的腦壓印片,且不需要細胞培養和冷凍切片,可在獲得病料后2 h內得出結果。黃駿明等[4]建立了直接免疫熒光(fluorescent antibody,FA)技術,取病豬腦組織,主要是三叉神經、延腦、脊髓等組織作冰凍切片進行FA檢查,可直接檢測組織培養、試驗感染和自然感染病料中的PRV,并在2 h內報告結果,適用于現地偽狂犬病的診斷。

    5.2.2 微量血清中和試驗 方六榮等[5]報道應用細胞培養微量中和試驗(固定病毒稀釋血清法)對來自24個豬場共426份血清進行了豬偽狂犬病血清學調查,檢出陽性血清171份,血清陽性率達40.1%,出現血清陽性的豬場有20個。李曉慧等[6]采用SNT和LAT兩種方法對吉林省8個地區的1 050份血清進行了檢測,確定吉林省豬偽狂犬病血清陽性率為21.7%,兩種方法血清檢出率經統計學分析差異不顯著。

    5.2.3 ELISA 婁高明等[6]建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA。對人工感染兔和自然感染豬的組織臟器檢測,結果發現扁桃體、腦和肺的檢出率最高,其次為心、肝、脾、腎等組織。

    Moutu、Afshar、Bush、蔣玉雯等分別建立了檢測PRV抗體的常規ELISA方法。黃駿明等應用混合纖維素酯微孔濾膜作固相支持物建立了斑點ELISA,并對1 337頭份豬血清進行了豬偽狂犬病血清抗體檢測,Dot­ELISA的敏感性顯著高于SNT。曹三杰等[7]建立了Dot­PPA­ELISA,可檢測IgG的最低含量為1.398×10-8 g。目前,中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的Dot­ELISA試劑盒已投入使用[8]。Prudhomme I等[9]將PRV gD基因插入桿狀病毒載體中進行表達制備重組抗原,建立了競爭ELISA(competitive ELISA,cELISA),利用該方法能檢測到PRV感染14 d后豬血清陽轉情況。

    20世紀90年代,很多學者研究建立了多種鑒別ELISA方法。其中,van Oirschot等利用感染細胞單層作抗原,抗gE表位的單克隆抗體作指標抗體,建立了檢測PRV gE抗體的競爭酶聯免疫吸附試驗gE­ELISA。Morenkov等建立了兩種檢測抗偽狂犬病gE抗體的間接ELISA,其中重組­gE­ELISA是利用大腸埃希菌表達gE基因N末端氨基酸1位~125位的融合蛋白為基礎而建立的;親和層析­gE­ELISA是利用親和層析技術從病毒粒子中提純的天然gE蛋白為基礎而建立的。這兩種間接ELISA的敏感性和特異性均能區分gE基因缺失的疫苗免疫動物與野毒感染動物。Cook等建立了檢測抗gG抗體的血清學鑒別阻斷ELISA方法,即gG­ELISA,該方法可以區分gG基因缺失疫苗免疫動物與野毒感染動物,但其敏感性比常規ELISA低。Kit等利用表達的PRV糖蛋白gC作包被抗原,建立了gC­ELISA。國內唐勇等[10]利用gG基因表達產物建立了gG­ELISA,可特異區分gG基因缺失疫苗免疫豬和野毒感染豬。

    5.2.4 乳膠凝集試驗 日本的柴因勛對比了LAT和SNT,檢驗了1 659份血清樣品,發現LAT和SNT的相符程度達97.6% ,且由于LAT可以檢測有很強凝集活性的IgM,可以早于SNT檢測到PRV的抗體[9]。國內吳斌等做的同類試驗也表明LAT和SNT間無統計上的差異。近年,美國已經有商品化的LAT試劑盒供臨床使用。國內華中農業大學也研制成功了gG­LAT和gE­LAT試劑盒。

    5.3 分子生物學技術

    5.3.1 核酸探針技術 PRV在潛伏期間,病毒基因組存在于潛伏部位,雖不進行復制和翻譯,但可發生轉錄,存在病毒DNA和RNA。Gutekunst以H3標記的以PRV DNA為模板合成的cRNA為探針,對疫苗接種豬攻毒后采集的三叉神經節和扁桃體抽提DNA進行了雜交檢查。Robin等使用微量濾管將從組織抽提的DNA轉移至NC膜上,在高壓力條件下和與豬細胞DNA無交叉雜交反應的探針如P32標志的BamHⅠ酶切的PRV DNA片段進行斑點雜交,可檢出潛伏感染。Brown等用原位雜交檢測潛伏感染也取得成功。Maes R K等[11]以生物素和地高辛標記的探針對病料組織切片進行原位雜交,可從單個細胞水平上檢出潛伏感染病毒DNA。國內,郭萬柱等[12]應用P32標記的PRV 全基因組和重組質粒作探針,采用斑點雜交法能檢測出10 pg的PRV DNA,其靈敏度足以達到檢出潛伏感染豬組織中的PRV DNA。但雜交試驗在敏感性和重復性上易變,尤其是原位雜交,并且既費時又昂貴,難以推廣應用。

    5.3.2 PCR技術 PCR技術以其快速、敏感、易于操作等優點在問世后迅速被廣泛應用。Belak等應用gB基因引物率先建立了檢測PRV的PCR方法。Jestin等從鼻拭子抽提核酸,通過擴增PRV的gD基因序列檢測出了PRV。Talmage T B等[13]應用gB基因引物對活檢的扁桃體細胞或實質組織進行擴增,能應用于潛伏感染的檢查。其還應用gB基因的嵌套引物對PRV DNA進行扁桃體細胞內擴增,并應用原位雜交來探查細胞內擴增的DNA,大大提高了檢出率。Harding M J等[14]根據已發表的PRV序列資料,設計并合成了用來擴增PRV gD基因的引物,建立了能夠區分來自人和其他動物皰疹病毒的PCR方法。國內冉多良、石建平、李學伍等[15]、婁高明等[16]也分別建立了檢測PRV的PCR方法,試驗表明所建立的PCR方法可用于偽狂犬病的快速診斷和流行病學調查。

    此外,Scherba等根據gG和LacZ基因設計引物,建立了區分PRV疫苗株和野毒株的鑒別PCR方法。Hasebe等根據gD和gE­gI基因序列設計兩對引物,對人工感染Bartha、BUK以及另外5株野毒的豬組織進行擴增,能有效地區分強弱毒株。Katz等針對gE、TK基因設計引物,應用套式PCR能將PRV野毒株和不同疫苗株有效地分開。Schang等根據PRV gE或gD基因設計兩對引物,同時以豬核因子Ⅰ基因為內參照進行PCR擴增,通過Southern雜交和高效液相色譜分析擴增產物,建立了定量和鑒別PCR技術。Thiery等建立了檢測PRV急性和潛伏感染豬三叉神經節中DNA的熒光素標記定量PCR方法,其靈敏度達到5個~10個拷貝靶基因。國內冉智光等根據PRV gB和gE基因的序列各設計一對引物建立了復合PCR方法,可成功地將我國常用的疫苗株Bartha K61與多個野毒株區分開,可檢出10 pg病毒DNA。陳陸等[17]建立了gE/gB鑒別診斷方法,可以檢測潛伏感染。劉莉娜等[18]針對PRV 的gB、gD和gE基因序列建立了多重PCR鑒別診斷方法,能有效區分野毒株和基因缺失疫苗毒,可檢出106 pg三基因缺失疫苗毒和756 pg野毒株DNA。

    近年來,檢測PRV與其他豬病毒病的多重PCR方法也相繼建立。Huang C等[19]建立了檢測PRV、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)的多重PCR方法,該法靈敏度高,可檢測出10-4ng各種病毒DNA,可應用于臨床病豬的組織樣品(淋巴結、肺、脾、扁桃體)檢測。Cao S等[20]建立了檢測PCV­2、PPV和PRV的多重PCR方法,并檢測了137例多系統衰竭綜合征仔豬,可用于診斷野毒感染病例。Sámi L等[21]建立了檢測PRV、PPV和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的多重PCR方法,該法特異、敏感、快速,在60 min內出結果,可用于豬重要病原體的快速鑒別診斷。

    6 防控

    本病尚無有效治療藥物,疫苗的免疫接種是預防和控制豬偽狂犬病的根本措施。目前國內外已研制成功豬偽狂犬病的常規弱毒疫苗、滅活疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因缺失滅活疫苗,其他如病毒載體重組疫苗和基因疫苗尚處于實驗室研究階段[22-24]。其中基因缺失疫苗已在生產中發揮重要作用,尤其在美國和歐洲一些發達國家的PR根除計劃中功不可沒。第一代基因缺失疫苗為TK基因缺失疫苗;第二代基因缺失疫苗主要有TK-/gC-、TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gE-/ gG-等。國內郭萬柱等研制出了PRV-SA215 gE-/gI-/TK-/ LacZ +基因缺失疫苗;陳煥春等也成功研制出PRVgG-、gE-等單基因缺失滅活疫苗和TK-/gG-、TK-/gE-等雙基因缺失弱毒疫苗,并建立了相應的區分野毒感染和疫苗免疫動物的鑒別診斷方法,為我國實施豬偽狂犬病根除計劃提供了相應的技術和產品。除了免疫預防之外,還應采取綜合性的措施來控制豬偽狂犬病,如引種時加強檢驗檢疫、定期對環境進行消毒、嚴格控制人員來往、滅鼠、經常進行疫情監測等。

     來源:豬病新干線  作者:豬病新干線 
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