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    豬傳染性胸膜肺炎毒素基因工程弱毒活疫苗的研究
    http://www.dzyan360.cn | 時間:2011-05-06 06:38:26 | 關注人次[] | 字體設置:

    貝為成  陳煥春  何啟蓋  吳斌

    (華中農業大學動物醫學院   武漢430070

                   

    1.豬傳染性胸膜肺炎對養豬業的主要危害

    豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Pleuropneumonia)是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP)引起的以胸膜肺炎和出血性壞死性肺炎為特征的一種重要的豬呼吸道傳染病。各種年齡的豬對該病均易感,急性感染尤其是25-45日齡仔豬感染后,表現出極高的發病率和死亡率,發病仔豬迅速死亡,慢性感染主要影響豬的增重、降低飼料報酬、延長育肥時間。同時,急性感染耐過或隱性感染的豬成為帶菌者,為傳染性胸膜肺炎再次爆發和流行的潛在傳染源,給本病的控制和根除帶來困難。本病在臨床上常與副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella Multocida)、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(Porcine Respiratory and Reproduction Syndrome Virus,PRRSV)等混合感染,給世界養豬業造成巨大的經濟損失[1,2]。

    在我國,豬傳染性胸膜肺炎也已長期存在并廣泛流行。從臨床調查和檢測結果來看,該病在我國的一些集約化的大型豬場呈現出愈演愈烈的趨勢,已經成為嚴重影響我國養豬業健康發展的重要呼吸道傳染病之一[3,4]。尤其是自2000年以來,該病在全國呈爆發性流行,在上海、浙江、廣東、湖北、湖南、河南等地發病尤為嚴重,僅杭州郊區某豬場因該病就以造成近代3萬頭豬死亡。

    2.該病病原菌APP毒力和致病性相關的因素

    21  毒力因子

    APP毒力和致病性相關的因子還包括細菌毒素、細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、莢膜多糖(Capsular Polysaccharide,CP)、外膜蛋白(Outer Membrane Protein,OMP)、溶血蛋白(Hemolysin Protein,HP)、尿素酶(Urease)以及細菌對轉鐵蛋白攜帶的鐵的利用能力等[5,9,14,15]。大量的研究證實,決定APP毒力和致病性的主要因素是細菌毒素。

    22  幾種毒素的特性

    APP至少有4RTXRepeat of Toxin)毒素,稱為ApxActinobacillus Pleuropneumoniae-RTX-ToxinI,-II,-III,-IVA。其中Apx I有強的溶血活性,Apx II的溶血活性相對較弱,二者均有細胞毒性,含有這兩種毒素的APP菌株毒力強,Apx III無溶血活性,但有強的細胞毒性,其靶細胞包括豬肺泡巨嗜細胞和中性粒細胞。除了Apx IVA在所有12個血清型中均存在以外,每種血清型的APP最多只含Apx I,-II,-III中的兩種。

    各種血清型APP所含毒素種類見表1[7,8,9]。

     

    Apx毒素在不同APP血清型中的分布

    毒素類型

    APP血清型

    Apx I

    1

     

     

     

    5

     

     

     

    9

    10

    11

     

    Apx II

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

     

    11

    12

    Apx III

     

    2

    3

    4

     

    6

     

    8

     

     

     

     

    Apx IVA

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    10

    11

    12

    24  毒素基因分子結構

    Apx II只含有Apx IICA基因外,Apx I Apx III均包括Apx CABD 4個基因。其中A基因編碼毒素的結構蛋白,C基因編碼毒素激活因子,激活A蛋白與靶細胞結合并發揮毒素活性,BD基因產物為毒素分泌時所必需。在不分泌Apx I毒素的APP中同樣有Apx IBD基因存在,而Apx IICA的分泌是在Apx IBD的作用下完成的[6,10,11,12]。除了RTX毒素以外, APP合成II型莢膜,由Cpx ABCD 4個基因編碼,在Cpx ABCD編碼區的上游有4個與CP生物合成緊密相關的基因Cps ABCD。利用基因工程方法使Cps ABC基因缺失的血清型5aAPP突變株喪失形成CP的能力,但該突變株在培養基上繁殖更快,對補體作用更敏感,同時在經氣管內接種時對豬喪失致病力[5,15,16]。

    3.本病的預防和控制現狀

    31 藥物控制:

    本病原菌早期對大多數抗生素敏感,但近幾年該菌耐藥性現象越來越常見,常用藥物對本病已無明顯療效。本菌耐藥性增加和人們對無藥物殘留、綠色食品需求的必然選擇,導致抗生素在本病預防和控制等方面的應用必將受到嚴格限制和逐步禁止。

    32 免疫預防:應用安全、高效的新型疫苗進行免疫接種是預防該傳染病的有效措施。

    321 滅活疫苗:

    應用當地分離的優勢菌研制的單價或多價滅活疫苗,免疫效果較好,但僅能給免疫豬提供針對同一血清型菌株感染的抵抗力。由于傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型多種,而且各血清型之間交叉保護力較低,這就給應用傳統滅活疫苗對該病進行免疫預防帶來了極大的困難。

    322亞單位疫苗:

         應用一些與毒力有關的蛋白如莢膜、溶血素以及莢膜與毒素的混合物來制備亞單位疫苗,取得了一定的效果,但由于與本病免疫保護相關的免疫原有7種之多(三種細菌毒素和脂多糖等),而亞單位疫苗僅含單一或幾種免疫原,因而免疫保護力十分有限,而且需要多次注射;另外,通過物理和化學方法提取、純化和制備亞單位疫苗其成本高,疫苗的價格昂貴。

    323基因工程弱毒活疫苗:

        曾經感染APP存活的豬獲得了對所有12個血清型菌的再次感染的免疫力 。受這種現象的啟發以及對一些與APP毒力相關因子如毒素及轉鐵結合蛋白、外膜脂蛋白等的分子致病機理和本質的不斷了解,近十年來,國際上開始了對基因工程活疫苗的研究。

    利用分子生物學技術,對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌apxII基因進行特異性位點突變,構建基因工程突變株,研制基因工程活疫苗,此種疫苗可以提供針對多種血清型的交叉保護力,效果明顯優于傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗,具有廣闊的應用前景。 

     

    4.基因工程弱毒活疫苗研究

    41毒素基因的克隆

    基因克隆與表達。利用已發表的CP、Apx IIA、Apx IIIA基因的核苷酸序列,設計引物,利用PCR方法擴增相應基因的編碼區DNA,分別在大腸桿菌、酵母菌或昆蟲細胞中表達相應的蛋白質,對這些蛋白質的生物學特性和免疫學活性以及作為滅活疫苗免疫增效劑的進行研究。

    42 轉移質粒的構建

    利用PCR擴增或Southern blot方法制備分別含有Cps ABC、Apx IICA、Apx IIICA基因的APP基因組DNA片段,利用酶切或PCR擴增的方法缺失相應的Cps ABC、Apx IIC、Apx IIIC基因,構建含有與APP染色體同源序列的轉移質粒。

    43突變株的篩選與鑒定

    以胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌為親本菌,將重組轉移質粒pSK-CAmprClaI線性化以后通過電轉化導入親本菌中,同源重組后在Ampr存在下2-3天可長出重組子。apxII-/Ampr突變株構建的技術路線(圖1)。電轉化條件為:直徑0.2cm電轉化杯,800Ω電阻,2.5v電壓,電擊后抗性復蘇3小時。篩選得到的陽性重組子命名為WHC-Ampr。

    把電轉化產物涂布于含有氨芐青霉素的平皿后,2-3天長出重組子。提取重組子基因組DNA,以它為模板PCR擴增apxIIC基因和Ampr基因,看是否能擴增出大小為1.8kb apxIIC基因特異性DNA片段和1.3kb Ampr基因片段。如果擴增結果與預期相符,那么可初步鑒定篩選的突變株是正確的。

    44 突變株穩定性和安全性研究

    apxII-/Ampr突變株在固體培養基連續傳代6次,用PCR鑒定,看每一代的突變株是否都能擴增出1.8kbapxIIC基因特異性片段和1.3kbAmpr基因片段。若能,表明突變株是能夠穩定遺傳的。

    500ul,濃度分別為2×107CFU/ml,2×108CFU/ml,2×109CFU/ml,2×1010CFU/ml的突變株菌液和親本菌菌液腹腔注射小白鼠對apxII-/Ampr突變株進行安全性測定,每一梯度接種10只,注射后觀察一周,主要觀察小白鼠食欲、精神狀態及其它臨床癥狀。

    分別用1ml1×109CFU細菌數的突變株菌液和親本菌菌液,采用氣管內各接種4頭小豬,注射后觀察一周,主要觀察小豬食欲、精神狀態及其它臨床癥狀。

    45突變株中抗生素報告基因置換及其疫苗生產

    用綠熒光蛋白(GFP)基因置換插入的外源報告基因Ampr后,進一步全面測定apxII-/GFP+單基因工程突變株的生物學特性,按新獸藥證書的要求開展一系列實驗,研制出豬傳染性胸膜肺炎單價基因工程活疫苗。

     

     來源:豬病新干線  作者:貝為成 陳煥春 何啟蓋 吳斌 
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